研究背景：

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种常用的石油基合成聚合物，由于其成本低、经久耐用、阻隔能力强，因此广泛应用于塑料瓶、产品包装和纺织等领域。然而，高度的耐用性和耐潮湿性也使得PET废弃物在环境中累积，造成了严重的环境污染。目前，PET废弃物的回收方法主要有物理回收、化学回收和生物回收，近年来，生物回收由于可以为PET废弃物再利用提供一条“绿色路线”而备受关注。目前已经鉴定出多种具有PET水解活性的酶，然而活性和鲁棒性仍然限制了其解聚性能。为了提高PET酶的解聚性能，研究人员采用了多种措施，其中定向进化是一种有效的方法来调整酶的性能，包括活性、选择性、热稳定性和有机溶剂稳定性，定向进化后酶活性的检测通常是基于高效液相色谱（HPLC），通过定量PET解聚后产物的含量来测定酶活性，然而到目前为止，还没有96孔微量滴定板（MTP）荧光法来检测PET酶定向进化的报道。

研究内容：

中科院的Shi Lixia等人开发了一种基于化合物2-羟基对苯二甲酸双羟乙酯（BHET-OH）水解形成荧光产物2-羟基对苯二甲酸（TPA-OH）的96孔MTP格式的高通量筛选方法，用所建立的实验进行了三轮定向进化，并检测了进化后酶的活性和对PET的降解性能。

主要研究结果：

1. PET酶定向进化示意图。通过epPCR生成基因多样性，使用BHET-OH法进行epPCR文库的迭代筛选。对改进的变体进行纯化和定量，用于PET解聚。采用高效液相色谱法测定水解产物TPA和MHET的含量。

2. （a）BHET-OH法筛选PET酶突变文库的反应机理。（b）BHET-OH法中底物BHET-OH（2 mM）和产物TPA-OHA（2 mM）的荧光发射光谱。（c）BHET-OH法中不同浓度比的底物BHET-OH和产物TPA-OH的校准曲线。

3. 利用BHET-OH荧光法鉴定水解活性和热稳定性提高的PET酶变体。（a）PET酶定向进化的关键阶段总结，反应中产生的TPA-OH的荧光强度每秒钟的线性增加率代表PET酶的活性，黑色箭头表示在定向进化中获得的变体顺序。（b）WT及其变体在不同温度热处理30 min后的酶活性。（c）WT及其变体在不同温度热处理30 min后的剩余活性。（d）CD光谱法测定WT及其变体的Tm值。

4. 以gf-PET膜为底物测定PET酶WT和变体的解聚性能。（a）变体M4在40℃和45℃时的酶活性。（b）变体M5和FAST-PET酶在50℃时的酶活性。gf-PET膜浸泡在2940 μL氨基乙酸-氢氧化钠（pH 9.0，100 mM）缓冲溶液中，加入60 μL 0.5 mg/mL酶，所有测试均进行三次。

5. PET酶在PC-PET废弃物50℃酶解中的应用。（a）不同类型PC-PET废弃物完全解聚的时间过程。（b）不同类型PC-PET废弃物重量，完全解聚时间和解聚产物数量。（c）DSC测定PET薄膜的结晶度。（d）PC-PET在3 L生物反应器中完全解聚的时间过程。

研究结论：

开发了一种新型的高通量BHET-OH荧光法，用于PET酶的定向进化，其可以识别有利于PET解聚性能的远端氨基酸取代，并将这些有益的取代通过活性位点周围的环相互作用网络将稳定效应传递到活性中心，从而提高PET酶的性能，这为研究PET水解酶的结构功能关系提供了新的视角。本研究获得的变体在温和温度下表现出明显高于WT的PET解聚性能，证实了高通量BHET-OH实验对PET水解酶定向进化的适用性。

参考文献：

Complete Depolymerization of PET Wastes by an Evolved PET Hydrolase from Directed Evolution[J]. Angewandte Chemie, 2023.

原文链接：

https://doi.org/10.1002/anie.202218390